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注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

實驗(yan)過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(ying)目的(de)(de)(de)(de)基因的(de)(de)(de)(de)特異引物（在(zai)PCR反應(ying)中，新合(he)成的(de)(de)(de)(de)DNA是(shi)要(yao)接在(zai)一(yi)小(xiao)段序列上才能(neng)繼續按照模(mo)板(ban)DNA復制，而不能(neng)從(cong)無到有，憑空合(he)成。這一(yi)小(xiao)段序列就是(shi)你(ni)所要(yao)有設(she)計的(de)(de)(de)(de)引物。可(ke)以是(shi)DNA也可(ke)以是(shi)RNA，一(yi)般20多bp，需要(yao)根據你(ni)的(de)(de)(de)(de)模(mo)板(ban)鏈(lian)設(she)計。因此，擴增不同的(de)(de)(de)(de)基因需要(yao)設(she)計不同的(de)(de)(de)(de)引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含(han)dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作(zuo)步驟
1．在冰(bing)浴中，按以下次序將各成分加入一無菌(jun)0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                ; 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模(mo)板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至        ;       50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diao)整(zheng)好反應程序。將(jiang)上述混(hun)合液稍加離心，立(li)即置PCR儀上，執行擴(kuo)增。一般(ban)：在(zai)(zai)93℃預變性3-5min，進入循(xun)環擴(kuo)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循(xun)環30-35次，zui后在(zai)(zai)72℃ 保溫7min。
3．結束反(fan)應，PCR產(chan)物放(fang)置于(yu)4℃待電(dian)泳檢測(ce)或-20℃長期保(bao)存(cun)。
4．PCR的電(dian)泳檢測：如在反(fan)應(ying)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jin)行(xing)抽提反(fan)應(ying)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電(dian)泳檢測。
三(san)、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模(mo)板所選用的(de)方(fang)法對污染的(de)風險(xian)有(you)極大影響(xiang)。一般而言，只(zhi)要(yao)能夠得到可靠的(de)結果，純化的(de)方(fang)法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的(de)污染(ran)。操(cao)作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大(da)體積配制，試驗一下(xia)是否滿意，然后分裝(zhuang)成僅夠一次使用的量儲(chu)存，從而確(que)保(bao)實驗與實驗之間(jian)的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中(zhong)都要使(shi)用一次性(xing)滅(mie)(mie)菌的塑料瓶(ping)和管子，玻璃(li)器皿應洗滌干凈并高壓滅(mie)(mie)菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反(fan)應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huan) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶(mei)標(biao)板(ban)：一塊（96孔）
2、 標準品(pin)（凍干(gan)品(pin)）： 2瓶，請臨用前15分鐘(zhong)內配制(zhi)。每瓶以樣品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)液(ye)稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)至0.5ml，蓋好后(hou)室溫靜置大約(yue)10分鐘(zhong)，同時反復顛(dian)倒/搓動以助溶解(jie)，其(qi)濃度為200 U/L，然后(hou)做系列倍比稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)（注：不要直接在(zai)板中(zhong)(zhong)進行倍比稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)），分別(bie)配制(zhi)成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)液(ye)直接作為空白(bai)孔 0 U/L。如配制(zhi)100 U/L標準品(pin)：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的(de)上(shang)述(shu)標準品(pin)加入含有(you)0.3ml樣品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)液(ye)的(de)Eppendorf管中(zhong)(zhong)，混勻即可，其(qi)余濃度以此(ci)類(lei)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢(jian)測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
性成纖維生長因子6-吲哚

大內皮素-1（1-38），人1-丁基-甲基咪唑四氟酸鹽

大內皮素-1 （1-39），豬18-冠-6

腦鈉素-32，大鼠5-氨基-甲基-1,2,噻二唑

鈴蟾(chan)肽三(san)叔丁氧基氫化鋁鋰(li)

緩激肽(S)-(-)-N-芐基-alpha-甲基芐

緩激肽（1-5）甲基-甲

緩激肽（1-6）氨基-三氟甲氧基甲

緩激肽（1-7）6--3,二氫-1H-2-萘酮

頰肽甲(jia)氧基噻吩

酸酶，雞環甲酸

降鈣素，人(S)-2-基-1-

降鈣素，大鼠芐氧羰酰基甘氨酸

降鈣素基因相關肽（8-37），人5-溴

降鈣素基因相關肽Ⅱ，人硫酸銨

降鈣素基因相關肽，大鼠2,3,三氟溴

蛋白酶1底物2m，熒光基-氟甲酸

蛋白酶3底物1m，熒光6-氨基-2-酚

ATP5AFST/FITC  熒光素(su)標記抗卵泡(pao)抑素(su)IgG20 ul

即刻早期基因ARCF1 operon positive regulatory proin(NT)/FITC  熒光素標記鼠疫耶爾森氏菌F1莢膜蛋白（N端）IgG100 ul

ADP核糖基化因(yin)子6F1 operon positive regulatory proin(CT)/FITC  熒(ying)光(guang)素標(biao)記鼠(shu)疫耶爾森(sen)氏(shi)菌(jun)F1莢膜蛋白（C端(duan)）IgG20 ul

芳香化酶Gab1/FITC  熒光素標記兔抗、大、接頭蛋白Gab 1IgG100 ul

ArminGab2/FITC  熒光素標記接頭蛋(dan)白Gab 2IgG100 ul

alpha 1腎上腺(xian)素(su)(su)能受體(ti)APhospho-Gab1 (Tyr627) /FITC  熒光素(su)(su)標記兔抗、大(da)、接頭蛋白Gab 1IgG1 ml

血管緊張素Ⅱ-1型受體Phospho-Gab1 (Tyr659) /FITC  熒光素標記兔抗、大、接頭蛋白Gab 1IgG100 ul

活化轉錄因子3GABA-AR Alpha1/FITC  熒光素標記γ1氨基丁酸受體α1IgG100 ul

血管緊縮素樣蛋白1GABA-B-R1/FITC  熒光素標記抗g-氨基丁酸B1受體IgG100 ul
大豆內源基因Lectin核酸試劑盒廠家1號染(ran)色體開(kai)放閱(yue)讀框50抗體2,3-Dimethoxyxanthone中(zhong)文名：2,3-二甲(jia)氧基呫噸酮別名：分子式：C15H12O4

1號(hao)染(ran)色體開放閱讀框49抗(kang)體Swertianin 2-O-α-L- rhampyrasyl-(1→2)-β-D-xylopyraside中文名(ming)：別名(ming)：7-O-[α-L-Rhampyrasyl-(1→2)-β-D-xylo pyrasyl]-1,8-dihydroxy-3-methoxyxanthone分子式：C25H28O14

1號染色(se)體開放(fang)閱讀框53抗體1,5-Dihydroxy-6,7-dimethoxyxanthone中文名：1,5-二羥基(ji)(ji)-6,7-二甲(jia)氧基(ji)(ji)呫噸酮別名：分(fen)子式：C15H12O6

1號染色體(ti)開(kai)放(fang)閱讀框54抗體(ti)Symphone I中文(wen)名：別名：分子式：C38H48O6

1號染色體開放閱(yue)讀框55抗體Hyperxanthone中文名(ming)：別(bie)名(ming)：分子式：C18H14O5